توسط : 
در Conventional PCR، Amplification در دستگاه Thermal Cycler انجام می‌شود، اما مقدار محصول معمولاً در پایان واکنش ارزیابی می‌گردد. یکی از روش‌های رایج، جداسازی محصول روی Agarose Gel Electrophoresis است. در این حالت مشاهده Band در اندازه مورد انتظار می‌تواند نشان‌دهنده حضور محصول هدف باشد.
محدودیت‌های روش Endpoint
اندازه‌گیری در پایان واکنش لزوماً اطلاعات دقیقی از فاز نمایی PCR نمی‌دهد؛ زیرا واکنش ممکن است وارد Plateau شده باشد. همچنین مراحل پس از PCR مانند بازکردن لوله و انتقال محصول برای Gel می‌تواند زمان و خطر آلودگی با Amplicon را افزایش دهد. همین نیازها یکی از زمینه‌های توسعه Real-Time PCR بود.
Reverse Transcription PCR (RT-PCR)
RT-PCR زمانی استفاده می‌شود که ماده هدف RNA باشد. مرحله نخست Reverse Transcription است که RNA را به cDNA تبدیل می‌کند. سپس cDNA با PCR تکثیر می‌شود. این روش می‌تواند به‌صورت One-step انجام شود، یعنی Reverse Transcription و PCR در یک Workflow پیوسته باشند، یا به‌صورت Two-step که ابتدا cDNA ساخته و سپس بخشی از آن در PCR جداگانه استفاده می‌شود.
Real-Time PCR یا qPCR چیست؟
در Real-Time PCR، تشکیل محصول PCR در هر چرخه با اندازه‌گیری سیگنال Fluorescence پایش می‌شود. بر خلاف Conventional PCR که نتیجه عمدتاً در پایان مشاهده می‌شود، Real-Time PCR امکان مشاهده روند Amplification در زمان انجام واکنش را فراهم می‌کند. این روش می‌تواند برای Detection کیفی یا برای Quantification، در صورت طراحی و کالیبراسیون مناسب Assay، استفاده شود.
CDC دو رویکرد رایج Fluorescence را توضیح می‌دهد: DNA-binding dyes مانند SYBR Green که به DNA دو رشته‌ای متصل می‌شوند، و Sequence-specific probes مانند TaqMan که اختصاصیت بالاتری برای Target مشخص دارند. سیستم‌های مولکولی بالینی بسته معمولاً از Probe-based chemistry برای تشخیص اختصاصی و Multiplexing استفاده می‌کنند.
Amplification Curve و Cq/Ct
نمونه منحنی‌های Amplification در qPCR و مفهوم Threshold
در qPCR، Fluorescence پس از تصحیح Baseline در برابر شماره Cycle رسم می‌شود. Threshold در محدوده‌ای از فاز نمایی قرار داده می‌شود و Cycleی که منحنی از Threshold عبور می‌کند با اصطلاح Cq یا در بسیاری از سیستم‌ها Ct گزارش می‌شود. به‌طور کلی، اگر سایر شرایط برابر باشند، نمونه‌ای که مقدار اولیه Target بیشتری دارد زودتر از Threshold عبور می‌کند و Cq/Ct پایین‌تری خواهد داشت.
Ct/Cq یک عدد مطلق و قابل‌مقایسه بین همه دستگاه‌ها و همه Assayها نیست. مقدار آن تحت تأثیر Assay design، PCR efficiency، Threshold setting، Sample input و روش پردازش قرار دارد. بنابراین نباید بدون Validation، یک Ct خام را بین پلتفرم‌های متفاوت مقایسه کرد.
